توضیحات

محیط کشت اوره آگار:

محیط کشت اوره آگار محیط کشت میکروبی جامد و افتراقی است که برای شناسایی

و تمایز میکروارگانیسم های اورولتیک(تجزیه کننده اوره) فرموله شده است.

هدف از کشت این محیط ,افتراق انتروباکتریاسه(متنوع ترین و بزرگترین باسیل گرم منفی از نظر پزشکی)،

افتراق بین گونه های بروسلا(عامل بیماری تب مالت یا بروسلوز)،

شناسایی گونه های کورینه باکتریوم اوره آز لیتیکوم (شایع ترین عامل ایجادکننده اورتریت غیرگونوکوکی)،

هلیکوباکتر(عامل زخم معده و سرطان معده) و

همچنین این آزمایش برای تشخیص مخمر های کپسول دار (کریپتوکوکوس نئوفورمانس) و

بعنوان یک تست اضافی برای تشخیص بعضی از کوکوباسیل های گرم منفی بکار میرود.

گونه های پروتئوس(پروتئوس ولگاریسم و پروتئوس میرابیلیس) همگی اوره آز مثبت هستند و

می توان آنها را ازانتروباکتریاسه(کلبسیا و سیتروباکتر) تشخیص داد.

بسیاری از میکروارگانیسم ها به ویژه آنهایی که باعث عفونت مجاری ادراری می شوند آنزیم اوره آز مثبت تولید میکنند.

محیط کشت اوره آگار

CHRISTENSEN در سال 1964 آزمایش تمایز باسیل روده ای را انجام داد و

urea agar base که برای آزمایش فعالیت اوره آز استفاده میشد بنام او نام گذاری شد.

او مشاهده کرد افزودن پپتون ژلاتین، دکستروز و کاهش ظرفیت بافر محیط( برای شناسایی مقادیر کم آمونیاک)

از رشد در مرحله اول پشتیبانی می کند و بنابراین موجوداتی با فعالیت اوره آز تاخیری نیز با اوره آگار کریستنسن تشخیص داده می شوند.

(درحالیکه  محیط اوره براث برای موجوداتی با فعالیت اوره آز بالا مانند پروتئوس ها کاربرد دارد.)

موجوداتی که دارای اوره آز مثبت می باشند، به ترتیب زیر آورده شده است.

5- Helicocobacter	1- Proteus
6- Klebsiella	2- Cryptococcus
7- Sarprophyticus	3- Ureaplasma
8- Epidermidis	4- Nocardia

آنزیم اوره آز

اوره ترکیب نیتروژنی است که شامل یک گروه کربونیل متصل به دو گروه آمین می باشد.

در داخل بدن، اوره از طریق چرخه اوره از آمونیاک تشکیل شده و محصول نهایی متابولیسم پروتئین است.

تجزیه اوره باعث افزایش اسمولالیته پلاسما و در نتیجه افزایش جریان آب از بافت ها از جمله مغز،

مایع مغزی نخاعی و چشم به داخل مایعات بینابینی و پلاسما می شود.

درنتیجه فشار در این بافت ها کاهش می یابد و جریان ادرار افزایش می یابد.

اوره در محیط طبیعی (آب و خاک) و همچنین در بدن انسان یافت می شود.

در انسان اوره عامل عملکرد طبیعی کلیه است.

بزرگسال سالم روزانه حدود 30 گرم اوره دفع می کند. با این حال این ماده نه تنها در ادرار،

بلکه در سرم خون، عرق و حتی معده نیز وجود دارد. هیدرولیز اوره توسط اوره آز یک فرایند پیچیده است.

در مرحله اول به یک مولکول آمونیاک و یک مولکول کاربامات ظاهر می شود.

در محلول آب، کربامات خود به خود به مولکول دوم آمونیاک و اسید کربنیک تبدیل میشود و آمونیاک بعدی نیز پروتون میشود.

این فرایند منجر به افزایش ph  میشود.

اوره توسط بسیاری از باکتری ها، قارچ ها، گیاهان و حتی برخی از بی مهرگان تولید میشود.

باکتری اورولیتیک ممکن است به فلور طبیعی یا عوامل بیماری زا تعلق داشته باشد.

در باکتری های بی هوازی اختیاری ناشی از فلور روده، سطح این فعالیت متنوع و مشخصه گونه است.

همچنین فعالیت اورولیتیک اغلب در باکتری های بیماری زا مشاهده می شود.

همچنین ویژگی مشخصه سویه های استافیلوکوک بیماری زا است.

بیش از 90 درصد از سویه های استافیلوکوکوس اورئوس مقاوم به متی سلین، قادر به هیدرولیز اوره هستند.

اوره آز آنزیمی است که توسط مایکوباکتریوم های بیماری زا مانند مایکوباکتریوم توبرکلوزیس و مایکوباکتریوم بوویس سنتز میشود.

اوره آز حاوی نیکل است که برای کسب خصوصیات هیدرولیتیک آن به فعالیت چند پروتئین اضافی نیاز دارد.

این فرایند شامل کدگذاری ژنهای پروتئین های آنزیمی ساختاری و همچنین ژن هایی است که پروتئین جانبی را کدگذاری میکنند.

اوره آزهای باکتریایی آنزیم های چند مولفه ای هستند که از دو یا سه پلی پپتید تشکیل شده اند.

مثلا در پروتئوس میرابیلیس 3 زیرواحد ساختاری وجود دارد:

زیرواحد گاما:11 کیلو دالتون  ure A

زیرواحد بتا: 12.2 کیلو دالتون ure B

زیرواحد آلفا:61  کیلو دالتون Ure C

این زیرواحد ها توسط سه ژن(به ترتیب Ure A،Ura B، Ure C) کدگذاری شده اند.

در هلیکوباکتر اوره آز منحصر به فرد است و از دو زیرواحد تشکیل شده است:

زیرواحد آلفا و بتا که توسط ژنهای Ure A  و UreB کدگذاری شده اند.

محیط کشت اوره آگار  باکتریایی به صورت آپوآنزیم های  های غیرفعال تشکیل می شوند که

از سه یا دو نوع پلی پپتید کدگذاری شده توسط ژنهای ساختاری خاص تشکیل شده اند.

(آپوآنزیم بخشی از پروتئین آنزیم است که فاقد کوفاتور است.)

اوره آز با اتصال به پیوند کربن _ نیتروژن در ترکیبات آمیدی همانند اوره سبب گسستن پیوند میشود.

فعالیت اوره آز یکی از خصوصیات مهم برای تشخیص پروتئوس ولگاریسم و پروتئوس میرابیلیس می باشد و

همچنین  برای شناسایی گونه های پروتئوس  از اعضای انتروباکتریاسه غیر تخمیرکننده لاکتوز استفاده کرد.

در محیط کشت اوره آگار آمونیاک تولیدی توسط میکروارگانیسم سبب افزایش ph می شود و

رنگ محیط از زرد به صورتی روشن (فوشیا) تبدیل میشود و همچنین آمونیاک بعنوان منبع نیتروژن برای رشد باکتری لازم است.

اوره، ترکیبی بی رنگ و بی بو است و در مقادیر کم سمی نمی باشد.

 

 

ترکیبات :

ترکیبات محیط کشت اوره آز مطابق جدول زیر می باشد.

2 g	Potassium dihydrogen phosphate	1 g	Peptone
0.012 g	Phenol red	1 g	(Dextrose) Glucose
12 g	agar	5 g	Sodium chloride

 

از ژلاتین پپتون بعنوان منبع تامین کننده پروتئین، فنول رد بعنوان شناساگر،

سدیم فسفات تعدیل کننده  محیط اسمزی، دکستروز(گلوکز) تامین کننده انرژی موردنیاز و

پتاسیم فسفات شناساگر قلیا در محیط استفاده می شود.

کنترل کیفیت

Remarks	Growth	Microorganism
Urease (-)	Good to very good	Escherichia coil ATCC 25922
Urease (-)	Good to very good	Enterobacter aerogenes ATCC 13048
Urease (+)	Good to very good	Proteus mirabilis ATCC 12453
Urease (+)	Good to very good	Proteus vulgaris ATCC 6380
Urease (+)	Good to very good	Proteus mirabilis ATCC 29906
Urease (-)	Good to very good	Salmonella typhimurium ATCC 14028
Urease (+)	Good to very good	Proteus mirabilis ATCC 43071

انکوباسیون در دمای 35 الی 37  به مدت 18 الی 24 ساعت انجام شود.

برخی از سویه های آزمایش شده:

کنترل مثبت اوره آز : پروتئوس ولگاریس ATCC 9484

کنترل منفی اوره آز : اشرشیاکلای ATCC 25922

مشخصات فیزیکی :

Urea agar base (Christensen):

پودر کم آب، ریز و همگن، صورتی رنگ (ph نهایی :6.8، دما:20  الی 25  درجه سانتیگراد)

Urea 40%:

ظاهری بی رنگ، محلول (دما 35 الی  37)

تفسیر آزمایش

پس از انکوباسیون در دمای 35 الی 37 تغیر رنگ از زرد به صورتی روشن(فوشیا)

بعد از دو، چهار، شش، هجده . بیست و چهار ساعت مشاهده میشود.

میزان رنگ نشان دهنده میزان هیدرولیز اوره است.

مثبت مثبت(strong positive) :کل لوله صورتی رنگ میشود.

مثبت (positive):شیب صورتی رنگ مشاهده میشود.

مثبت ضعیف(weak positive): بالای لوله(سطح لوله) صورتی دیده میشود.

درمورد زمان واکنش قلیایی مشاهده میشود:

سویه های مثبت سریع(rapid positive):1 الی 6 ساعت زمان لازم است مانند پروتئوس،مورگانلا

سویه های مثبت تاخیری: به طور معمول پس از 6 ساعت واکنش مثبت ضعیفی ایجاد میشود که

در اثر انکوباسیون طولانی مدت(تا6 روز) واکنش تشدید میشود مانند کلبسیا و انتروباکتر.

برای باکتری های دیگر به جز انتروباکتریاسه (مثل بردتلا و بروسلا) شیب تلقیح بیشتر شده و 4 الی 6 روز انکوباتور میشود.

آماده سازی محیط کشت اوره آگار

21  گرم پودر را در  950 میلی لیتر آب سرد سوسپانسیون شود و به نقطه جوش برسد(مرتبا هم بزنید) و

اتوکلاو نموده و در دمای 121 درجه  به مدت 15  دقیقه استریل شود. سپس خنک شود و

به دمای 47 الی 50 درجه برسد. سپس 50 میل اوره 40 درصد را اضافه کنید.

به دقت داخل لوله توزیع و سرد شود و در حالت Slant  جامد قرار گیرد.

محدودیت ها

برای معتبر بودن نتایج آزمایش برای ارگانیسم های اوره آز مثبت سریعُ مثل پروتئوس شیب را در دو الی شش ساعت اول بخوانید.

محیط آزمایش به اثبات قلیایی بودن وابسته است و مخصوص فعالیت اوره آز نیست.

پپتون ممکن است باقیمانده اسیدآمینه را هیدرولیز کند و باعث افزایش ph شود و در نتیجه واکنش مثبت کاذب میشود که

برای کنترل از محیط کشت بدون اوره برای تخمیر واکنش های مشکوک میتوان استفاده کرد.

این محیط صرفا برای آزمایشگاه است و باید درب قوطی کاملا بسته باشد و

از تابش شدید نور آفتاب جلوگیری شود و درجه رطوبت کمتر از 60 درجه باشد.

تفاوت محیط کشت اوره آگار با اوره براث

اوره براث (stuarts) محیطی مایع است که توسط استوارت و همکاران

برای تمایز گونه های پروتئوس از سایر جنس های انترواکتریاسه ساخته شده است.

(انتروباکتریاسه بعلت بالا بودن ظرفیت بافری محیط اوره براث و همچنین کم بودن مواد مغذی توانایی استفاده از اوره را ندارد.)

محیط اوره براث برای ازبین بردن خاصیت بافری محیط مقدار زیادی آمونیاک توسط باکتری تولید می کند,

درحالیکه در محیط اوره آگار مقدار اندک آمونیاک تولیدی توسط میکروارگانیسم  نیز شناسایی میشود.

ترکیب این محیط از رشد عالی پروتئوس پشتیبانی میکند و فعالیت اوره آز را در موجوداتی که مثبت تاخیری هستند می پوشاند

و برای تشخیص فعالیت اوره آز  در پروتئوس و مورگانی بکار میرود.

 

جهت مشاهده انواع فیمت محیط کشت ها لطفا روی کلمه لیست قیمت کلیک فرمایید.

همچنین از بازدید سایت شارلو غافل نمانید!!!!

جهت اخذ مشاوره و خرید تجهیزات آزمایشگاهی با کارشناسان ما در هلدینگ KTG تماس حاصل بفرمایید.