کاربرد دستگاه کلنی کانتر

روش های بیولوژیکی اغلب به تعداد دقیق کلنی ها و سلول های باکتری بستگی دارند. شمارنده های کلنی برای برآورد تعداد میکروارگانیسم ها  در یک محیط مایع با شمارش کلنی های جداگانه روی صفحه آگار ، سرسره ، مینی ژل یا ظرف پتری استفاده می شوند. از این دستگاه  در آزمایش Ames ، سنجش جهش باکتریایی و کلنی های باکتری E. coli استفاده می شود. این ابزارها اندازه ها و قالب های مختلفی دارند ، از جمله واحدهایی که می توانند صفحات را تا 300 × 300 میلی متر اسکن کنند و برای استفاده با نور ماورا بنفش ، نور سفید ، فلورسنت و / یا کلنی های سبز فلورسنت بهینه شده اند.

شمارش می تواند به صورت دستی انجام شود یا می تواند نیمه یا کاملاً خودکار باشد. با استفاده از شمارنده های خودکار ، به نتایج دقیق تر و صحیح تر دست می یابید.

روش های شمارش کلنی

• روش خودکار: این روش تعداد کلنی ها را در یک رقت مشخص نشان می دهد.
• روش دستی : با استفاده از کلنی کانتر نیمه اتوماتیک یا دستی، پلیت را به صورت وارونه بر روی یک صفحه سفید یا سیاه قرار داده
• و بین پلیت و صفحه یک شیشه شطرنجی قرار دهید و با علامت گذاری خانه ها را شمارش کنید.

اجزای دستگاه کلنی کانتر

• صفحه شطرنجی کلنی کانتر: این دستگاه شامل یک صفحه شطرنجی با LED های 16 وات است و نور مناسبی را برای کاربر تامین می کند.
• ذره بین مجهز به لامپ داخلی
• قلم: سنسوری فشاری می باشد و با فشار دادن قلم روی محیط کشت شمارنده دستگاه فعال می شود و شمارش شروع می شود.

شمارش باکتری ها

در جنبه‌های مختلف باکتری‌شناسی، پس از شناسایی باکتری‌ها در بسیاری مواقع شمارش باکتری‌ها و تعیین تعداد آن‌‌ها در واحد حجم ضروری است. این شمارش به خصوص در مورد باکتری‌های بیماری‌زا اهمیت بسزایی دارد. با شمارش در محدوده‌های زمانی مشخص می‌توان سرعت تکثیر باکتری و گسترش عفونت و بیماری در بدن یک فرد بیمار و یا در قلمرو گسترده‌تر در یک جامعه پی برد. در بحث شمارش و تعیین تعداد باکتری تاکنون روش‌های مختلفی در بین متخصصان میکروبیولوژی به‌کار رفته است. در بعضی موارد با کمک اندازه‌گیری مقدار گاز تولید شده در مورد باکتری‌های تولید‌کننده گاز در شرایط آزمایشگاهی در لوله آزمایش تعداد باکتری‌ها را می‌توان به‌صورت نسبی به دست آورد.

در مواردی با اندازه‌گیری میزان کدورت ایجاد شده در محیط کشت تعداد باکتری‌ها را می‌شود مشخص کرد. البته، در روش کدورت‌سنجی اندازه همه باکتری‌ها، اعم از زنده و غیرزنده مشخص خواهند شد. شمارش با پلیت‌های استاندارد (روش کمی) یکی دیگر از روش‌های شمارش باکتری‌های موجود در شیر، آب و مواد غذایی است. از این روش در مراکز آزمایشگاهی بیشتر استفاده می‌شود و درصد اطمینان آن نیز بالاتر است. در انجام این روش‌ها، تهیه رقت از باکتری‌های مورد مطالعه در طی مراحل مختلف بسیار مهم است.

استفاده از رقت‌سنجی برای شمار باکتری‌ها در مراکز آزمایشگاهی واحدهای نگهداری و تهیه شیر و مواد غذایی و همچنین در تصفیه آب کاربرد فراوانی دارد. با توجه به اینکه سرعت رشد باکتری‌ها در شیر و مواد غذایی خاص زیاد است، لذا کیفیت شیر و یا مواد غذایی به مرور زمان دستخوش تغییرات زیادی می‌شود. بر همین اساس شناسایی نوع میکروب و تعداد‌ آن در واحد حجم اهمیت فراوان دارد. برای بدست آوردن اطلاعات بیشتر در مورد انواع کلونی کانتر لطفا به صفحه کلنی کانتر مراجعه بفرمایید.

اجرای آزمایش و روش کار شمارش باکتری

در این آزمایش از باکتری اشریشیاکلی برای تهیه رقت و شمارش استفاده می‌شود.

مواد لازم:

محیط کشت باکتری ـ نوترینت آگار‌ـ‌ ارلن یا بشرـ پلیت‌های آزمایشگاهی (4 عدد یا بیشتر و مضربی از 4)‌ـ لوله‌های آزمایش‌ـ ظروف یا بطری‌های شیشه‌ای ـ پیپت ـ بن‌ماری یا گرم‌خانه. در اجرای این روش حداقل از سه شیشه و در صورت امکان از شیشه‌های بیشتر استفاده کنید، نتایج حاصل از این روش از اطمینان بیشتری برخوردار است.

الف) در ابتدا 80 سی سی از محلول نوترینت آگار را به مدت 8 دقیقه می‌جوشانیم تا کاملاً ذوب شود و سپس آن را در بن‌ماری به مدت ده دقیقه قرار می‌دهیم و آن را تا دمای 50 درجه سرد می‌کنیم و برای مراحل بعدی کنار می‌گذاریم.

یادآوری: می‌توانیم دانش‌آموزان را به دو یا سه گروه و یا بیشتر تقسیم کنیم و برای هر گروه یک دسته 4 تایی از پلیت‌های حاوی محیط کشت همانند قبل در نظر بگیریم. با این کار و تکرار آزمایش توسط گروه‌های دیگر نتیجه آزمایش در کل اطمینان بیشتری خواهد داشت.

ب)  در مرحله بعد، برای هر گروه سه شیشه یا لوله آزمایش را علامت‌گذاری می‌کنیم و\ آن‌ها را به نام‌های A-B-C می‌نامیم و در هر کدام 99 میلی‌لیتر آب مقطر می‌ریزیم.

1. یک سی‌سی از محلول حاوی باکتری (در این‌جا اشریشیا کلی) را در شیشه A می‌ریزیم تا به غلظت  برسد.

2. از ظرف A یک میلی‌لیتر محلول باکتریایی برداشته و در شیشه دوم (B) که حاوی 99 میلی‌لیتر آب است، می‌ریزیم تا به رقت  برسد.

3. دوباره یک سی‌سی از لوله آزمایش B را برمی‌داریم و در شیشه سوم (C) که محتوی 99 سی‌سی آب مقطر است می‌ریزیم تا رقت را به  (یک میلیونیوم) برسانیم. هر سه شیشه را به آرامی به مدت 7 ثانیه و حدود 25 بار تکان می‌دهیم.

ج) در مرحله بعد، برای هر یک از گروه‌های دانش‌آموزی یک دسته 4 تایی از پلیت‌ها را در نظر می‌گیریم و بعد از شماره‌گذاری از 1 تا 4 به ترتیب زیر عمل می‌کنیم: هر گروه دانش‌آموزی از شیشه B به کمک پیپت یک بار 1 میلی‌لیتر و بار دیگر 0/1 میلی‌لیتر را برمی‌دارد و به ترتیب در پلیت‌های اول و دوم می‌ریزد. سپس از شیشه C به کمک پیپت یک‌بار یک سی‌سی و بار دیگر 0/1 سی‌سی را برمی‌دارد و در پلیت‌های سوم و چهارم می‌ریزد.

نتیجه این مرحله:  بدین‌ترتیب پلیت‌های باکتریایی به ترتیب شماره از یک تا چهار به ترتیب:رقت را خواهند داشت.

د)  به پلیت‌های حاوی باکتری با رقت‌های متفاوت در مرحله بعد هر کدام یک چهارم از محلول ذوب شده محیط کشت (20 سی‌سی) که در مرحله اول تهیه شده بود را اضافه می‌کنیم و سپس آن‌ها را به مدت 48 – 72 ساعت به‌صورت وارونه در گرم‌خانه (آون) در دمای 35 درجه سانتی‌گراد قرار می‌دهیم تا باکتری‌ها رشد و تکثیر یافته و کلنی‌ های مختلف ایجاد شوند.

تذکر 1: برای رقت‌های بیشتر می‌توانیم از شیشه‌های بیشتری استفاده کنیم (هرچه شیشه‌ها بیشتر رقت‌ها هم بیشتر خواهد بود یعنی محلول میکروبی رقیق‌تر که تعداد میکروب‌های آن در شمارش میکروبی کمتر خواهند بود و این کار شمارش را دقیق‌تر و آسان‌تر خواهد کرد)

تذکر 2: اگر در آزمایشگاه فقط یک دستگاه گرم‌خانه موجود باشد بهتر است هر گروه پلیت‌های خود را نامگذاری کنند. برای شمارش کلنی‌ ها روی پلیت‌ها، می‌توانیم از دستگاه کلنی شمار استفاده کنیم و یا از کاغذ صافی با منافذ معین مخصوص با خطوط ریز عمودی و افقی استفاده کنیم.

پلیت‌ها را روی دستگاه کلنی شمار قرار می‌دهیم و تعداد کلنی‌ ها را با کمک ذره‌بین می‌شماریم. در شمارش با کمک کاغذ صافی ابتدا هر کدام از رقت‌های باکتریایی مورد نظر را با اضافه‌کردن آب به یک لیتر می‌رسانیم و سپس هر یک را از کاغذ صافی عبور می‌دهیم. به این ترتیب باکتری‌ها در منافذ کاغذ باقی‌ می‌مانند.

در مرحله بعد کاغذهای صافی مورد نظر را روی پلیت‌های حاوی محیط کشت (نوترینت آگار) قرار می‌دهیم و سپس مجموعه را به مدت 48 ساعت در دمای 35 درجه در گرم خانه‌ قرار می‌دهیم تا باکتری‌های روی کاغذ صافی روی محیط کشت رشد کنند و کلنی‌های میکروبی ایجاد کنند.

یادآوری: بهتر است قطر کاغذهای صافی به اندازه قطر دهانه پلیت‌ها باشند و همه سطح پلیت را بپوشانند. پس از 2 تا 3 روز هر گروه پلیت‌های خودشان را از گرم‌خانه بیرون بیاورند و تعداد کلنی‌های ایجاد شده در تک‌تک پلیت‌ها را بشمارند و پلیت‌هایی را که تعداد کلنی‌های بیشتر و بزرگ‌تر دارند، انتخاب کنند (پلیت‌هایی را انتخاب کنید که بین 30 تا 300 کلنی داشته باشند). در این مرحله برای تعیین مقایسه‌ای تعداد باکتری‌ها در محیط کشت ابتدا راهنمایی‌های لازم را به دانش‌آموزان می‌دهیم.