Real time PCR چیست؟

Real-time PCR برای نظارت بر پیشرفت یک واکنش (PCR (Poly Chain Reaction  استفاده می‌شود. امروزه تکنیک‌های تکثیر و شناسایی اسید‌های نوکلئیک از مهم‌ترین ابزارهای پژوهش‌های زیستی و ژنتیکی به شمار می‌آیند.

دانشمندان در همه زمینه‌های علوم زیستی، بیوتکنولوژی، پزشکی، پزشکی قانونی، تشخیصی و … از این روش‌ها در طیف گسترده‌ای از کاربردها استفاده می‌کنند. برای برخی از کاربردها، تشخیص کیفی اسید نوکلئیک کافی است. در حالی که تحقیقات در سایر زمینه‌ها نیاز به تجزیه و تحلیل کمی دارند. Real Time PCR می‌تواند برای تجزیه و تحلیل کمی و کیفی اسیدهای نوکلئیک مورد استفاده قرار گیرد.

در این مطلب به بررسی روش Real Time PCR، تکنیک‌های کمی PCR با رونویسی معکوس و معرفی ابزارهایی که تاکنون برای این تکنیک‌ها ارائه شده، می‌پردازیم.

همچنین راهنمایی‌هایی درباره مراحل جداسازی RNA مانند جمع آوری نمونه، استخراج RNA و تجزیه و تحلیل کیفیت و کمیت RNA ارائه می‌کنیم. در PCR معمولی، محصول DNA تکثیر شده یا آمپلیکون در یک تحلیل نقطه انتهایی شناسایی می‌شود.

در حالی که PCR در زمان واقعی، تجمع محصول ایجاد شده را در طی روند پیشرفت واکنش  PCR به طور همزمان نشان می‌دهد, به طوری که کمیت محصول پس از هر بار انجام چرخه PCR اندازه‌گیری می‌شود.

مراحل انجام PCR در زمان واقعی در شکل زیر مشخص شده است. در اولین مرحله، اجزای واکنش‌های PCR رشته‌های هدف به همراه پرایمرهای اختصاصی آماده می‌شوند. سپس اجزای واکنش‌ PCR با توجه به پروتکل مشخص، در لوله‌های واکنش‌ با هم ترکیب می‌شوند و لوله‌ها درون دستگاه PCR در زمان واقعی قرار می‌گیرند. پس از تنظیم دستگاه، واکنش PCR شروع می‌شود. همزمان با شروع چرخه‌های PCR داده‌های جمع آوری شده توسط نرم افزار یا ابزار اختصاصی دستگاه مورد تجزیه و تحلیل قرار می‌گیرند.

این روش امکان اندازه گیری هم زمان محصولات PCR  شامل DNA,RNA,cDNA را فراهم می‌کند.

تشخیص به وسیله تکنیک PCR در زمان واقعی، با اضافه کردن یک مولکول فلورسنت به عنوان گزارشگر به محصولات PCR در هر لوله واکنش انجام می‌گیرد، به طوری که با پیشرفت واکنش و افزایش مقدار DNA تولید شده در هر چرخه، فلورسانس ایجاد شده به وسیله مولکول گزارشگر نیز افزایش می‌یابد که این افزایش با حسگرهای دستگاه قابل شناسایی است.

Real-time PCR مبتنی بر تشخیص فلورسنت تولید شده توسط یک مولکول گزارشگر می‌باشد. مقدار نور تولید شده با ادامه واکنش، افزایش می‌یابد. این امر به دلیل تجمع محصول PCR در هر چرخه می‌باشد.

 مولکول‌های گزارشگر فلورسنت شامل رنگ‌های متصل شونده به DNA دو رشته (SYBR® Green)  و یا پروب‌های مخصوص توالی  (Beacons Molecular) می‌باشند. در این روش چون به مقدار زیادی از الگو نیاز نیست، در نتیجه در میزان استفاده از منبع الگو و زمان صرفه جویی می‌شود.

امروزه Real-time PCR با داشتن حساسیت بسیار بالا و سهولت در انجام کار، بسیار مورد استفاده قرار می‌گیرد.

روش Real time PCR

در پروتکل Real-time PCR، از یک مولکول گزارشگر فلورسنت برای نظارت بر پیشرفت واکنش استفاده می‌شود. فلورسانس ساطع شده توسط مولکول گزارشگر با تجمع محصول PCR در هر چرخه تقویت می‌شود. بر اساس مولکولی که برای تشخیص استفاده می‌شود، تکنیک‌های این روش را می‌توان به دو دسته تقسیم بندی کرد:

1. تشخیص غیر اختصاصی با استفاده از رنگ‌های متصل شونده به DNA.

2. پروب‌های اختصاصی برای تشخیص یک باند خاص در توالی DNA.

تشخیص غیر اختصاصی با استفاده از رنگ‌های متصل شونده به DNA

در این روش، از رنگ‌های متصل شونده به DNA به عنوان گزارشگرهای فلورسنت برای نظارت بر واکنش PCR  استفاده می‌شود. با ثبت میزان انتشار فلورسانس در هر چرخه، می‌توان واکنش PCR را در فاز توصیفی کنترل کرد.

نمودار بین مقدار الگو شروع کننده واکنش و افزایش نور فلورسانت ایجاد شده توسط  رنگ گزارشگر در طول Real-time PCR، یک نمودار خطی می‌باشد.

SYBR® Green  پرکاربردترین رنگ مورد استفاده برای اتصال به  DNA دو رشته است.

SYBR® Green به شیار کوچک مارپیچ DNA متصل می‌شود. در حالت محلول، رنگ متصل نشده، فلورسانس بسیار کمی را ساطع می‌کند. این فلورسانس زمانی که رنگ به DNA دو رشته متصل شود افزایش می‌یابد. اتییدیم برماید نیز می‌تواند برای تشخیص استفاده شود، اما ماهیت سرطان زا بودن آن، استفاده از آن ار محدود می کند.

اگرچه این رنگ‌های متصل شونده به دو رشته DNA ساده ترین و ارزانترین گزینه می‌باشد، اما اشکال اصلی در استفاده از این رنگ‌ها، تولید سیگنال توسط محصولات اختصاصی و غیر اختصاصی است.

تشخیص اختصاصی با استفاده از پروب‌های هدفمند

در این روش از پروب‌های الیگونوکلئوتیدی که با هر دو رنگ فلورسنت و quencher برچسب گذاری شده است، استفاده می‌شود.

این پروب‌ها شامل:

آ. مولکول‌های Beacons
ب کاوشگر TaqMan®
ج پروب هیبریداسیون FRET
د آغازگرهای Scorpion®

کاربرد Real-time PCR

1 مطالعات کمی بیان mRNA.
2 اندازه گیری تعداد کپی DNA در DNA ژنومی یا ویروسی.
3بررسی تمایزآللی یا ( SNP(Single Nucleotide polymorphism.
4 تأیید نتایج Microarray .
5بررسی اثربخشی دارو درمانی.
6 اندازه گیری میزان آسیب DNA.

تفاوت Real-time PCR و  PCR کلاسیک

Real-time PCR امکان تشخیص محصول PCR را در مراحل اولیه واکنش فراهم می‌کند. این توانایی اندازه گیری سینتیک واکنش در مراحل اولیه PCR یک مزیت محسوب می‌شود. در روش‌های کلاسیک از الکتروفورز ژل برای تشخیص PCR در مرحله نهایی واکنش PCR استفاده می‌کنند.

در حالیکه در Real-time PCR شناسایی محصول در همان چرخه‌های اول با استفاده از نور فلورسنت امکان پذیر می‌شود. جهت به دست آوردن اطلاعات بیشتر در مورد PCR کلاسیک بروی کلمه کلیک کنید. سایر محصولات به سایت ما به آدرس www.ktglabgroup.com مراجعه نمایید.

اگر به دنبال قیمت‌های استثنایی هستید صفحه لیست قیمت ما را مشاهده کنید. لطفا جهت اخذ مشاوره و استعلام قیمت با کارشناسان شرکت کیمیا طب گستر تماس حاصل بفرمایید.