الایزا ریدر و الایزا واشر چیست؟

الایزا ریدر و الایزا واشر یکی از پرکاربرد ترین تست های ایمونولوژی و سرولوژی است که برای تائید حضور آنتی بادی ها و آنتی ژن ها استفاده می شود. تست الایزا به منظور ردیابی آنتی ژن و یا آنتی بادی به کار می رود به طوری که یکی از دو ماده در بستر جامد ثابت و ردیابی می شود.

الایزا ( Enzyme-linked immunosorbent assay )

یکی از رایج ترین روش‌های ارزیابی ایمنی نشاندار است. در این روش ، حضور آنتی بادی یا آنتی ژن در نمونه به طور مستقیم و یا به وسیله ی آنتی بادی نشاندار ثانویه روی سطح جامد تعیین می شود. آنتی بادی‌های نشاندار شده با آنزیم قادر به تشخیص آنتی ژن ثابت در یک سطح جامد، مانند صفحات پلی استرین 96 یا 384 خانه است. و بسترای آنزیم به بستر اضافه می‌شود و با توجه به مقدار آنتی ژن موجود در نمونه، تغییر رنگ یا سیگنال نوری ایجاد می‌شود.

این یک روش ساده و سریع برای تشخیص آنتی بادی‌ها یا آنتی ژن‌های متصل به یک سطح جامد است. ELISA به عنوان یکی از حساس ترین روش‌های ایمنی، در تحقیقات آزمایشگاهی، تشخیص بیومارکرهای بیماری و کنترل کیفیت در صنایع مختلف، ارزش تجاری را ارائه می‌دهد.

کاربرد دستگاه الایزا

طیف گسترده‌ای از کیت‌های ELISA برای تشخیص صدها پروتئین و مولکول مختلف از جمله سایتوکاین‌ها، فاکتورهای رشد، نشانگرهای بیماری‌های عفونی، دیابت و تومورها، داروها و مولکول‌های کوچک در ایمونولوژی و سرولوژی مورد استفاده قرار می‌گیرند.

همچنین از تست الایزا در بخش هورمون شناسی استفاده می شود. بسته به نوع ترکیب، روش الایزا به 4 دسته تقسیم بندی می‌شود :

• 1-  روش الایزا مستقیم.
• 2-الایزا غیر مستقیم.
• 3- الایزا ساندویچی.
• 4- الایزا رقابتی.

دستگاه الایزا ریدر ،  میکروپلیت ریدر و یا خوانشگر میکروپلیت فتومتر یک دستگاه اسپکتوفتومتری اختصاصی است که وظیفه ی خوانش تست الایزا را به عهده دارد.

تفاوت اسپکتروفتومتر های عمومی و اختصاصی در چیست ؟

اسپکتوفتومتر های عمومی جذب نوری را در گستره وسیعی از طول موج می خواند در حالیکه در اسپکتوفتومتر های اختصاصی مانند الایزا ریدر دارای فیلتر ها یا گریتینگ های انکساری بوده که گسترش طول موج ها را محدود کرده است. میکروپلیت ریدر دستگاهی است که سیگنال‌های نوری تولید شده توسط نمونه‌هایی را که درون یک میکروپلیت قرار گرفته‌اند تشخیص می‌دهد.

خواص نوری این نمونه‌ها نتیجه یک واکنش بیولوژیکی، شیمیایی، بیوشیمیایی یا فیزیکی است. طیف گسترده‌ای از سنجش ها را می‌توان با استفاده از دستگاه میکروپلیت ریدر انجام داد. این سنجش‌ها شامل :

• ELISA.
• سنجش رشد سلول.
• اندازه گیری اسید نوکلئیک و پروتئین.
• اندازه گیری فعالیت آنزیم.
•  ایمونو اسی و غربالگری ترکیبات و اهداف دارویی می‌باشد.

الایزا ریدر مانند یک اسپکتروفوتومتر اختصاصی برای آنالیز نتایج تست الایزا مورد استفاده قرار می‌گیرد. بدین گونه که با ایجاد طیف خاصی از امواج معمولا بین 400 تا 750 نانومتر، جذب را خوانش می‌کند.

آماده کردن میکروپلیت‌

انواع بسیاری از میکروپلیت‌های ELISA از نظر تجاری در دسترس هستند. رایج ترین نوع پلیت‌ها، شامل پلیت‌هایی با 8 ستون و 12 ردیف می‌باشند که در مجموع 96 چاهک را برای کاربر فراهم می‌کند.

وسایل مورد نیاز برای انجام الایزا

از تجهیزات مورد نیاز می‌توان به موارد زیر اشاره کرد:

دستگاه الایزا ریدر: برای قرائت جذب نوری توسط نمونه‌ها.

الایزا واشر (شست و شو دهنده چاهک ها):

شست و شوی نمونه‌ها در مواقعی که تعداد نمونه‌ها کم باشد، می‌تواند به صورت دستی انجام شود. اما در آزمایشگاه‌هایی که تعداد نمونه‌ها زیاد باشد، بهتر است برای جلوگیری از هدر رفتن زمان و کاهش میزان آلودگی، از الایزا واشر استفاده کنید.

میکروپیپت به عنوان توزیع کننده : به منظور توزیع نمونه‌ها، محلول‌های شست و شو در دستگاه بهتر است از میکروپیپت‌های چند کاناله (8 یا 12 کاناله) استفاده شود.

انکوباتور: دستگاه‌های انکوباتور به منظور فراهم آوردن شرایط بهینه برای انجام واکنش‌ها در چاهک‌ها و انکوبه کردن میکروپلیت‌ها، مورد استفاده قرار می‌گیرند.

اصول فرآیند الایزا

به طور کلی الایزا شامل مراحل زیر می شود:

1- آنتی بادی و یا آنتی ژن‌های مورد نظر، در چاهک‌های موجود در میکروپلیت کوت (coat) می‌شوند.

2- نمونه‌ها در داخل میکروپلیت‌ها ریخته می‌شود و در انکوباتور، به منظور اتصال آنتی بادی‌های موجود در نمونه به آنتی ژن‌های کوت شده و یا اتصال آنتی ژن‌های موجود در نمونه به آنتی بادی‌های موجود در میکروپلیت در دمای مشخص  انکوبه می‌شوند.

3- بعد از انکوباسیون، نوبت به شست و شوی آنتی ژن و یا آنتی بادی‌های متصل نشده می‌رسد. این کار توسط محلول‌های بافری شست و شوی مناسب انجام می‌شود.

4- سپس یک آنتی بادی ثانویه به نام کونژوگه، که حاوی آنزیمی برای انجام واکنش‌های بعدی می‌باشد، به میکروپلیت‌ها اضافه می‌شود.

5- در این مرحله میکروپلیت‌ها مجددا برای برقراری پیوند بین آنتی بادی کونژوگه و کمپلکس آنی بادی – آنتی ژن در داخل انکوباتور قرار می‌گیرند.

6- با به پایان رسیدن زمان انکوباسیون، برای حذف آنتی بادی‌های کونژوگه متصل نشده،مرحله شست و شو دوباره انجام می‌شود.

7- در این مرحله سوبسترای آنزیم متصل شده به آنتی بادی کونژوگه، به چاهک‌ها اضافه می‌شود و میکروپلیت‌ها در داخل انکوباتور قرار می‌گیرند. آنزیم شروع به تبدیل سوبسترا به محصول کرده و با این کار تغییر رنگ در چاهک‌ها ایجاد می‌شود.

8-بعد از اتمام زمان انکوباسیون، به منظور توقف واکنش آنزیمی، یک معرف به نمونه‌ها اضافه می‌شود.

9- در این مرحله میکروپلیت‌ها به دستگاه الایزا ریدر به منظور خوانش جذب نوری، منتقل می‌شوند. سپس با استفاده از اعداد خوانده شده توسط دستگاه، نوبت به رسم نمودار و تجزیه و تحلیل آماری نمونه‌ها،

که مهمترین مرحله کار می‌باشد، می‌رسد. دقت نمایید که به منظور کنترل مراحل انجام شده، باید نمونه های استاندارد و کنترل نیز در چاهک ها داشته باشید.

نگه داری از دستگاه الایزا ریدر

از دستگاه الایزا ریدر مانند ساید تجهیزات موجود در آزمایشگاه‌ها باید مراقبت نمود.

• کالیبراسیون دستگاه مرتب چک شود.
• بررسی کنید سیستم‌های نوری دستگاه تمیز هستند.
• با روشن نمودن دستگاه، ابتدا با محلول بلانک، دستگاه را کالیبر نمایید.
• در حفظ  نگه داری دستگاه کوشا باشید.

در زیر مشخصات فنی انواع دستگاه‌های الایزا ریدر ایرانی و خارجی موجود در هلدینگ KTG را مشاهده می‌کنید.

نتیجه گیری

از سری تجهیزات تشخیص دهنده سطح ایمنی نمونه، دستگاه های الایزا ریدر و الایزا واشر هستند که می توانند میزان غلظت آنتی ژن و آنتی بادی را درون یک نمونه جامد مشخص کنند. به طور کل دستگاه ‌های الایزا به واسطه دقت عمل و حساسیت بالایی که در کار دارند جزء مطمئن ترین تجهیزات آزمایشگاهی و کنترل کیفی به شمار می روند. دستگاه الایزا ریدر متشکل از یک صفحه پلی استایرن ۹۶ چاهی (میکروپلیتی) است. بسته به هدف آزمایش این دستگاه ها به شکل خاصی عمل می کنند. اگر هدف، بررسی میزان آنتی بادی در نمونه باشد به کف هر چاهک آنتی ژن چسبانده می شود. در صورتی که هدف آزمایش شناسایی آنتی ژن در نمونه باشد، چیزی که به کف هر چاهک متصل می شود آنتی بادی است. تست الایزا به ۴ روش ساندویچی، رقابتی، مستقیم و غیر مستقیم انجام می ‌شود که در این میان روش ساندویچی رایج ترین نوع آن است.