کروماتوگرافی چیست؟

کروماتوگرافی یک روش فیزیکی جداسازی است که در آن اجزایی که باید جدا شوند , بین دو فاز توزیع می شوند که یکی از آن ها ساکن است و دیگری در جهتی معین حرکت می کند. یک ابزار جامع و قوی برای جداسازی و کمیسازی بسیاری از آنالیت های آزمایشگاهی می باشد.

ماهیت پیچیده رنگ آمیزی گیاهی، گیاه شناس روسی،میخائیل تسووت را به یافتن راهی برای جداسازی رنگدانه ها به اجزاء اصلی شان هدایت نمود. او دریافت که رنگدانه های گیاهی به تعدادی نوارهای رنگی بر روی یک ستون کربنات کلسیم مجزا شده اند. به علاوه او فهمید که جداسازی توسط جذب تفاضلی رنگدانه ها بر روی سطح کربنات کلسیم ایجاد شده است. کروماتوگرافی به حرکت نسبی دو فاز مبتنی است.

یک فاز ساکن و یک فاز متحرک برحسب ماهیت فاز متحرک و ساکن طبقه بندی می شوند. فاز ساکن می تواند مایع یا جامد باشد و فاز متحرک می تواند گاز یا مایع باشد. اگر فاز ساکن جامد باشد کروماتوگرافی را جذب سطحی و اگر فاز ساکن مایع باشد تقسیمی می نامند. در کروماتوگرافی جذب سطحی، اساس جداسازی اختلاف بین جذب سطحی اجزاء می باشد ولی در تقسیمی اساس جداسازی اختلاف میان ضرایب تقسیم اجزاء است.

به طورکلی روش های تقسیمی برای جداسازی ترکیبات شیمیایی نزدیک به هم مانند اعضاء مشابه یک خانواده مناسب تر است ، ولی روش های جذب سطحی برای جداسازی انواع مختلف ترکیبات شیمیایی بهتر هستند.

مزیت اصلی روش های تقسیمی این است که نوارهای کروماتوگرافی به علت عدم وجود دنباله نسبتا باریک و در نتیجه استفاده از ستون ها کارآمد تر است.

تئوری استفاده از دستگاه کروماتوگرافی:

در طول فرآیندکروماتوگرافی ملکول های حل شونده وارد یک بستر یا ستون از فاز ساکن می شود. در کروماتوگرافی قراردادی، فاز ساکن بر سطح ذرات تکیه گاه قرار می گیرد.

حل شونده هایی که با فاز ساکن واکنش نشان نمی دهند، در فاز متحرک باقی می مانند و مهاجرت از طریق بستر یا ستون تنها توسط حامل های فیزیکی نشان داده شده توسط فاز ساکن یا ذرات تکیه گاه ممانعت می شود.

حل شونده هایی که به طور کامل با فاز ساکن واکنش نشان می دهند ، مهاجرت نمی کنند و در بستر یا ستون باقی می مانند. جداسازی و بازیافت تنها وقتی رخ می دهد که ملکول های حل شونده مرتبط با فازهای ساکن و متحرک در حال تعادل باشند.

به خاطر آن که یک حل شونده تنها وقتی در فاز متحرک باشد حرکت می کند، یک حل شونده با میل ترکیبی بالاتر برای فاز ساکن ، بسیار آرام تر از یک حل شونده با میل ترکیبی کمتر،مهاجرت می کند.

برعکس حل شونده ای که با فاز متحرک در تعادل باشد سریعتر از حل شونده ای که با فاز ساکن در حال تعادل باشد مهاجرت می کند.

کاربرد روش های کروماتوگرافی:

با این روش ها می توان جداسازی هایی را که به روش های دیگر خیلی مشکل می باشند انجام داد. زیرا اختلاف جزئی موجود در رفتار اجسام درهنگام حرکت بین دو فاز تشدید می شود و هرقدر این اختلاف بیشتر شود قدرت جداسازی بیشتر است.

یکی از مزایای برجسته این روش ها این است که شرایط انجام ان ها ملایم است. یعنی احتمال تجزیه اجسام جداشونده بوسیله این روش ها در مقایسه با سایر روش ها کمتر است.

مخصوصا درمورد ترکیباتی با دو غشاء زیستی و دارویی اهمیت دارد. ازدیگر مزایای این روش این است که تنها مقدار بسیار کمی از مخلوط برای تجزیه لازم است. تجزیه درمقیاس میکرو انجام می شود.

کروماتوگرافی مایع HPLC

کروماتوگرافی مایع HPLC با کارایی بالا (High Performance Liquid Chromatography -HPLC) از جمله روش ‌های جداسازی پر کاربرد در بسیاری از علوم آزمایشگاهی است. مهمترین و پرکاربردترین روش جداسازی، روش «کروماتوگرافی» محسوب می شود. روش کروماتوگرافی (Chromatography) را گیاه‌شناسی روسی به نام تسوت، در سال 1903 کشف کرد.

در اواخر سال 1960 آنالیستها با انتگرال گیریهای الکترونیکی آشنا شده بودند که می توانست سطح پیک شویش (elution band ) را اندازه گیری کرده و در نتیجه جداسازی بسیار خوبی برای یک مخلوط پیچیده در چند دقیقه یا حتی چند ثانیه بطور کامل ارائه دهد .

نانو گرم و بعضی اوقات پیکوگرم مقادیری بودند که بطور مطلوب می توانست ثبت  شود(1picogram=10^-12 ، 1 nano gram=10^-9) طبیعتاً مردم در این زمان مایل بودند در مورد نمونه های غیر فرار صحبت کنند که GC  برای آنها مناسب نبود. HPLC جدید در اثر نیاز بشر به حداقل کار ،مهارتهای تکنولوژی و تئوری هایی که بطور منطقی راهنمای او باشد بوجود آمد .

در بعضی نوشته ها HP  و HPLC  نشان دهنده ی فشار بالا ( high pressure) است. و برخی نیز با توجه به مشکلات مالی  آنرا پر بها (high –prised ) تغییر نموده اند .

ولی این کلمه در واقع به معنای عملکرد بالا ( high –performance ) می باشد . واضح است که قبل از دوره ی وسائل جدید ، LC ( liquid –choromatography ) قدرت زیادی در جدا کردن مولفه های بسیار نزدیک به هم داشته است بعنوان مثال :

جداسازی تبادل گر یون (ion exchange ) بطور موفقیت آمیزی در مورد خاکهای نادر دیده شد. در اوایل کار توسعه کروماتوگرافی مایعی ، دیده شد که برای بالا رفتن بازده و سرعت و منطبق کردن آن برای نمونه های بسیار کوچکتر باید قدمهای جدیدی برداشته شود . LC  باید سریعتر و اتوماتیک می گردید.

اسم کروماتوگرافی با عملکرد بالا (HPLC) اغلب بدین دلیل بکار میرود که این روش کارهای جدیدتری را از روشهای کلاسیک تمیز میدهد .

کروماتوگرافی مایع HPLC

 

جداسازی در کروماتوگرافی بر اساس مفاهیم فیزیکی، شامل دو دسته کروماتوگرافی ستونی (Column) و کروماتوگرافی سطحی است. اساس نام ‌گذاری در دسته‌بندی دوم که مرسوم‌‌تر است، نوع فاز متحرک، فاز ساکن و همچنین نوع تعادل ایجاد شده بین دو فاز است.

این دسته شامل دو گروه کلی کروماتوگرافی مایع که فاز متحرک، مایع است و کروماتوگرافی گازی که فاز متحرک گاز است، می‌شود. کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (High Performance Liquid Chromatography -HPLC)، بیشترین رشد و کارایی را داشته است

که علت آن، حساسیت بالا، تعیین مقدار کمی با صحت بالا، قابلیت آنالیز نمونه‌های غیرفرار و حساس به دما که با روش کروماتوگرافی گازی امکان‌پذیر نیست، قابل انجام است.

فروش ستون های HPLC

با استفاده از HPLC، آنالیز کمی و کیفی قابل انجام است. آنالیز کیفی، برای تشخیص و شناسایی نوع ترکیبات انجام می‌شود. به این صورت که از آنجایی‌که زمان بازداری (Retention Time) برای هر ماده در یک سیستم و شرایط خاص آزمایشگاهی ثابت و مشخص است،

کروماتوگرام آنالیت با کروماتوگرام به‌دست آمده از استاندارد آن آنالیت در شرایط یکسان آزمایشگاهی و دستگاهی مقایسه می‌شود و در صورت یکسان بودن زمان بازداری، با قطعیت نوع ماده تعیین می‌گردد.

برای تعیین کمی مقدار آنالیت نیز سطح زیر پیک و یا ارتفاع پیک ترکیب مجهول با نمونه استاندارد مقایسه می‌شود. در مواردی که پیک‌ها باریک و متقارن باشند، اندازه‌گیری ارتفاع پیک از صحت و سرعت بیشتری برخوردار است.

جهت آشنایی بیشتر لطفا به وب سایت Agilent مراجعه فرمایید. دستگاه HPLC شامل قسمت‌های مختلفی مانند مخازن حلال، موتور یا پمپ، تزریق‌ کننده و آشکارساز است که در تصویر زیر نشان داده شده است.

 

اجزاء و قسمتهاي مختلف دستگاه HPLC  

1) مخازن حلال:

كه در آنها فاز متحرك و يا حلالهاي شستشو دهنده ستون ريخته شده است.

2) موتور يا پمپ:

چون ستونها نسبتا طويل و اندازه ذرات كم است ,به اين جهت قابليت نفوذ كم مي شود و براي اين كه حلال جريان داشته باشد بايد فشاروجود داشته باشد.

براي ايجاد فشار از پمپ يا موتور استفاده مي كنيم. پمپ فشاري حدود psi 4500 مي تواند ايجاد كند و بايد بتواند فشار ثابت ايجاد كند. حلال توسط پمپ با فلوي ثابتي بر روي فاز ثابت حركت داده مي شود.

حداكثر فلوئي كه فاز متحرك مي تواند داشته باشد ml/min 2.5 است و بسته به نوع كاري كه مي خواهيم انجام دهيم فلو فرق مي كند، هر چه فلو كمتر باشد، فاصله ي پيك ها بيشتر است.

چهارمخزن داريم مخزنD, C, B, A ميزان فشار بستگي به فلوي ما دارد وقتي فلو ml/min 0.8 است ميزان فشار حدود psi 1500 مي شود. ميزان فشار بستگي به نوع ستون دارد حداكثر فشار مجاز Psi 3500 است. حداكثر تغييرات فشار Psi 100 است.

حداكثر فلو ريت Flow rate ، ml/min 2.5 است. پس پمپ، حلال را از مخزن مي گيرد و با سرعت گذر ثابتي آن را بداخل دستگاه وارد مي كند. در دماي آزمايشگاه كار مي كنيم.

3) تزریق کننده:

از سرنگهاي مختلف با ظرفيت هاي مختلف استفاده مي كنيم. حجم تزريق ۳۰ ميكروليتر است. نمونه ابتدا وارد قسمتي بنام گارد كالوم يا پري كالوم مي شود كه محافظ ستون است، طول كاردكالوم حدو يك سانتي متر است و جنس آن از فولاد ضد زنگ است، و ماده پركننده آن از جنس ماده پركننده ستون است.

اگر ماده ما ناخالصي داشته باشد يا با ماده داخل ستون واكنش ايجاد كند درگاردكالوم انجام مي شود و به ستون آسيبي نمي رسد.

4) آشکارسازها :

رديابها بايد حساس باشند و اثر مخرب بر روي اجسام نداشته باشند. پاسخ آنها تا حدود وسيعي براي غلظت بايد خطي باشد. عامل وجودی آشکارگر در HPLC , آشکار کردن فاز متحرکی است که از ستون بیرون می آید.

یک سری گسترده از وسایلی که بعضی از آنها پیچیده و حساس هستند به عنوان آشکارگر مورد استفاده قرار می گیرند. آشکار سازها به دو گروه اصلی آشکار سازهای با خاصیت گروهی و آشکارسازهای با خاصیت جسم حل شده طبقه بندی میشوند.

لطفا جهت اخذ مشاوره و استعلام قیمت کروماتوگرافی مایع HPLC و دیگر تجهیزات آزمایشگاهی , با کارشناسان ما تماس حاصل بفرمایید.