الکتروفورز و ژل داک چیست؟

الکتروفورز چیست؟

 الکتروفورز یک فرایند الکتروکینتیکی است که ذرات باردار شده را در بافر با استفاده از میدان الکتریکی جدا می‌کند. در بیولوژی برای جداسازی مولکول‌های پروتئین یا DNA و محصولات  PCR مورد استفاده قرار می‌گیرد. در آزمایشگاه‌ها برای جداسازی مولکول‌ها بر اساس اندازه، تراکم و خلوص استفاده می‌شود.

 الکتروفورز چگونه کار می‌کند؟

عبور مولکول‌ها از یک شبکه متخلخل، با ایجاد یک میدان الکتریکی انجام می‌شود. مولکول‌ها بر اساس اندازه، نوع و بار الکتریکی با سرعت‌های مختلفی حرکت می‌کنند. برخی از نمونه‌های کاربردی این روش شامل تجزیه و تحلیل DNA و RNA و همچنین الکتروفورز پروتئین است. این یک روش پزشکی برای تجزیه و تحلیل و جداسازی مولکول‌های موجود در یک نمونه سیال (معمولاً نمونه خون و ادرار) می‌باشد.

انواع الکتروفورز 

انواع مختلفی از ژل‌ های  الکتروفورز معمولاً به عنوان واسطه پشتیبانی استفاده می‌شوند. ژل‌ های افقی امکان آزمایش بسیاری از نمونه‌ها را دارند و به همین دلیل اغلب در آزمایشگاه‌ها مورد استفاده قرار می‌گیرند. با این حال، ژل های عمودی وضوح بهتری از نتایج به دست می‌آورند، بنابراین اغلب برای الکتروفورز پروتئین انتخاب می‌شوند. ژل آگارز معمولاً برای DNA استفاده می‌شود.

این ساختار دارای منافذ بزرگی است که مولکول‌های بزرگتر می‌تواند به راحتی حرکت کند، اما برای توالی کوچکتر مناسب نمی‌باشد.

ژل پلی آکریل آمید (PAGE) وضوح واضح تری نسبت به ژل آگارز دارد که آن را برای تجزیه و تحلیل کمی و جداسازی پروتئین‌های بزرگ، مناسب‌تر می‌کند. همان طور که ذکر شد تکنیک‌های الکتروفورز مولکول‌های باردار را در یک میدان الکتریکی جدا می‌کنند.  حرکت یک مولکول در میدان الکتریکی با اندازه آن رابطه معکوس و با میزان بار رابطه مستقیم دارد.  در طی الکتروفورز، پروتئین‌ها به سمت یک الکترود با بار متضاد در یک میدان الکتریکی حرکت می‌کنند.

میزان حرکت پروتئین‌ها در یک سیستم الکتروفورز علاوه بر خاصیت ذاتی مانند اندازه،  بار و شکل پروتئین‌ها توسط عوامل مختلفی مانند دما، pH و غلظت بافر نیز کنترل می‌شود. جداسازی پروتئین ها صرفاً بر اساس وزن مولکولی آن‌ها تنها درصورتی امکان پذیر است که بار تمام مولکول‌های پروتئین یکسان شود. در چنین حالتی ، تحرک مولکول‌های پروتئین صرفاً به اندازه آن‌ها وابسته خواهد بود. در این روش، بار تمام پروتئین توسط یک نوع دترجنت آنیونی به نام SDS، منفی می‌شود.

 پروتئین‌ها با استفاده از ماتریکس ژل ساخته شده از پلی آکریل آمید در یک میدان الکتریکی با توجه به اندازه از هم جدا می‌شوند. پلی آکریل آمید به عنوان یک نتیجه از واکنش پلیمریزاسیون بین آکریل آمید و N ، N’-متیلن بی-آکریل آمید (BIS)  با استفاده از یک کاتالیزور تولید می‌شود.

با تنظیم غلظت آکریل آمید و BIS می‌توان میزان پلیمریزاسیون یا اتصال متقابل را کنترل کرد. ژل‌ هایی با منافذ بزرگ (4-8٪ آکریلامید) به مولکول‌هایی با وزن مولکولی بالاتر اجازه می‌دهند سریع‌تر از طریق ژل حرکت کنند.  در حالی که ژل‌ هایی با منافذ کوچک(12-20٪ اکریلامید) مهاجرت مولکول‌های بزرگ را محدود کرده و  به صورت انتخابی اجازه می‌دهند تا پروتئین‌های کوچک بتوانند از طریق ژل حرکت کنند.

پروتکل SDS-PAGE

1. آماده سازی نمونه

2. تهیه ژل

3. الکتروفورز

4. رنگ آمیزی و تجسم

الکتروفورز دو بعدی( 2D) مولکول‌ها را در امتداد یک محور x و یک محور y جدا می‌کند. در این روش مولکول‌ها بر اساس بار و اندازه از هم جدا می‌شوند.

الکتروفورز هموگلوبین به عنوان یک آزمایش غربالگری برای شناسایی هموگلوبین‌های طبیعی و غیر طبیعی و ارزیابی میزان آن‌ها استفاده می‌شود. انواع هموگلوبین شامل هموگلوبین (A1 (HbA1 ، هموگلوبین (A2 (HbA2 ، هموگلوبین (F (HbF یا هموگلوبین جنین، هموگلوبین HbC و هموگلوبین HbS است.

وراثت جهش‌های ژنی بر روی ژن‌هایی که وظیفه تولید هموگلوبین را بر عهده دارند، باعث تولید انواع مختلف هموگلوبین‌های غیر طبیعی می‌شود.

دلایل استفاده از آزمایش الکتروفورز هموگلوبین عبارتند از: 

1. معاینه معمول برای تکمیل انجام آزمایش خون.

2. برای تشخیص اختلالات خونی

اگر بیمار علائم کم خونی را نشان دهد، ممکن است پزشک آزمایش الکتروفورز هموگلوبین انجام دهد. این آزمایش  به شناسایی هر نوع هموگلوبین غیر طبیعی در خون بیمار کمک می‌کند. حضور هموگلوبین غیر طبیعی می‌تواند نشانه یکی از بیماری‌های زیر باشد:

• کم خونی سلول داسی
  تالاسمی
  پلی سیتمی ورا

3.غربالگری شرایط ژنتیکی:

افرادی که سابقه خانوادگی کم خونی‌های ارثی مانند تالاسمی یا کم خونی سلول داسی دارند،

می توانند قبل از زایمان، غربالگری این اختلالات ژنتیکی را انجام دهند.

نوزادان همچنین از نظر این اختلالات هموگلوبین ژنتیکی به طور معمول مورد غربالگری قرار می‎گیرند.

این روش‌ها علی رغم تفاوت‌هایی که دارند، همگی به منبعی برای بار الکتریکی، یک وسیله پشتیبانی و محلول بافر نیاز دارند.

ژل داک 

یک ژل داک، به عنوان یک سیستم مستند سازی ژل، به تجهیزات گسترده ای که در آزمایشگاه های بیولوژی مولکولی برای تصویربرداری و اسناد از اسید نوکلئیک و پروتئین معلق در ژل های پلی آکریل آمید یا آگارز استفاده می‌شود ، اشاره دارد.

این ژل‌ها معمولاً با اتییدیم بروماید یا سایر رنگ‌های اسید نوکلئیک مانند GelGreen رنگ می‌شوند. بطور کلی ، یک ژل داک شامل یک UV ایلومینیتور ، یک هود یا اتاق تاریک برای محافظت از منابع نوری خارجی

و محافظت از کاربر در معرض اشعه ماوراء بنفش ، و یک دوربین CMOS برای گرفتن تصویر است.

تولید کنندگان اصلی سیستم های مستند سازی ژل عبارتند از Bio Rad، Azure، Bioolympics، Syngene، Vilber Lourmat، UVItec و Aplegen.

برنامه های کاربردی:

• قرابت اتصال آنتی بادی مونوکلونال و پلی کلونال.
• تصویربرداری از ژل و بلات.
• شمارش کلونی.
• ایمونواپی.
• تشخیص تولید پروتئین.
• خصوصیات اصلاح پس از ترجمه.
• الکتروفورز 2D
• بررسی پروتئین از نظر کمی.

اجزا تشکیل دهنده سیستم ژل داک

دوربین: دوربین ماوراء بنفش  در  1.4m تا 8.3m پیکسل.

لنزها: کلیه لنز ها با کامپیوتر کنترل می شوند و دارای موتور هستند. در اینجا لنزها بطور خودکار حرکات به سمت بالا یا رو به پایین نمونه را با استفاده از فوکوس خودکار انجام می کنند.

فیلترها: طیف گسترده ای از فیلترهای انتشار برای مجموعه ای از برنامه ها استفاده می شود. چراغ روشنایی بالای سر: نور سفید ، نور ماوراء بنفش و روشنایی LED
نور مرئی .

قابلیت تنظیم: این امکان را می دهد تا نمونه ها به دوربین نزدیکتر شوند.

اتاق تاریک: اتاق تاریک برای شیمی درمانی پیشرفته ، فلورسانس و کاربرد نور مرئی مناسب است. قفل درب اتوماتیک الکترونیکی با عملکرد امنیتی .

Transilluminator: شدت نور ماوراء بنفش متغیر و قابل تنظیم می باشد. همچنین دارای قطع امنیت می باشد. نمونه‌هایی که قرار است در چاهک‌های تانک الکتروفورز Run شوند، بهتر است روی یخ قرار بگیرند.

یخساز های موجود در هلدینگ ktg مناسب برای آزمایشگاه های میکروبیولوژی و ژنتیک.